小鼠細胞實驗分離和培養(yǎng)步驟:

1. 小鼠頸椎脫臼處死后，剃除腹胸部的被毛，放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在無菌環(huán)境下打開胸腔，取出心臟組織，注入盛有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中，洗凈組織表面的血液。

3. 將清洗干凈的心臟組織轉(zhuǎn)入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中浸泡15s以殺死大多數(shù)的心臟被膜細胞，浸泡完成后立即轉(zhuǎn)入裝有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗。

4. 清洗完成后，用剪刀鑷子配合除去主動脈弓和心房組織，僅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室內(nèi)的血液。

5. 將清洗干凈的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊，之后用PBS清洗若干次后按下述兩種方法之一進行后續(xù)操作。

A. 貼塊法

6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中，用0.25%yi蛋白酶消化液浸泡組織，室溫消化3-5 min。

7. 消化完成后，添加數(shù)毫升FBS終止消化，之后吸棄液體，加PBS清洗組織塊1伺次后，用200 ul吸頭將組織塊平均接種于T-25培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上，之后將培養(yǎng)瓶放置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，靜置2-4h。

8. 待組織處于略微脫水的狀態(tài)時，小心添加2ml培養(yǎng)基，添加時注意盡量不要將組織塊沖起，要使培養(yǎng)基接觸所有的組織塊。

9. 之后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，一般2-4天后成纖維細胞會從組織塊周圍爬出，待爬出的細胞有較多數(shù)量時，可將細胞消化下來，去除組織塊，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

B. 消化法

6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入混合消化液（0.08%yi酶+0.06%Ⅱ型膠原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上層混懸液棄去。

7. 余下組織加入混合消化液10 ml，37℃水浴震蕩消化10 min；吸取上層懸液至另一離心管中，加入適量FBS終止反應(yīng)；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至組織塊消化。

8. 按1∶1加入含血清的培養(yǎng)基，中止酶反應(yīng)，懸液過200目網(wǎng)篩去除較大的組織塊。

9. 收集全部中止后的消化液于離心管中，300g，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸細胞后計活細胞數(shù)。

10. 調(diào)整細胞密度以1× 106個/ml 接種入的T-25培養(yǎng)瓶中，每瓶添加2 ml細胞懸液。

11. 培養(yǎng)瓶放置于37℃，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置40min后，吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細胞和死細胞，再添加5 ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。