應用技術研究中心

仇偉，徐波

Flash純化柱是Flash純化體系的心臟，好比汽車里的發動機。工欲善其事，必先利其器，挑選正確的Flash純化柱是整個純化zui為關鍵的一環。而挑選合適的Flash純化柱就像茫茫的人海中挑選另一半一樣，高矮胖瘦、外貌、內涵品質各方面都要細細斟酌考慮。今天我們就聊聊純化柱的內涵——固定相。

圖1. 常州三泰科技有限公司SepaFlash系列純化柱產品

固定相也就是俗稱的填料，是色譜中zui為核心的部分。要確定Flash純化柱裝填的固定相，就要依次確定固定相三個方面的信息：基質種類、表面修飾/鍵合相、基質參數。

一、基質

基質是固定相構成的基本材料，常用的基質材料分為三大類：無機材料、有機材料以及復合材料。無機材料有：硅膠、氧化鋁等；有機材料主要是凝膠等聚合物材料；復合材料通常是指無機材料與有機材料通過雜化、涂覆、包覆等手段相結合的復合材料。

硅膠是在Flash純化中應用zui廣泛的基質，色譜用硅膠是多孔結構，具有高機械強度以及熱穩定性，優良的孔結構和比表面積，其表面含有大量的活性羥基，在正相純化體系中對化合物的分離純化起到非常重要的作用。同時硅膠表面容易修飾形成其他鍵合類固定相，以硅膠基質修飾而成的固定相種類繁多，且分離純化效果相比其他基質好很多。但硅膠基質在堿性條件下穩定性比較差，同時其羥基的存在對一些物質尤其對堿性物質容易造成不可逆吸附，此外在應用于一些生物分子樣品的分離純化時會對樣品產生非特異性吸附或使樣品變性，造成色譜圖中樣品洗脫的峰型變差以及樣品回收率降低。

氧化鋁基質機械強度高，化學穩定好，對一些化合物具有*的選擇性，對硅膠基質來說具有很好的互補性。但氧化鋁表面修飾比較困難，所以zui多還是應用于正相純化體系，少量應用在離子交換體系。

有機基質多是聚合物凝膠材料（如樹脂、聚苯乙烯二乙烯共聚物等），與硅膠相比有更好的化學穩定性（適用pH值范圍可以從1到12），與待分離的樣品基本不發生變性反應，也不容易產生不可逆吸附。通過修飾后應用在離子交換色譜、體積排阻色譜和反相疏水色譜等模式下，在蛋白質、糖類等生物分子的分離純化方面有著廣泛的應用。但相比較硅膠等無機基質來說，有機基質固定相能耐受的分離機械強度較低，分離純化效果較差，限制了其在純化方面的應用范圍。

復合基質是兼容并中和了無機基質和有機基質的優缺點，但一般復合基質相應的固定相都是價格昂貴，所以在制備純化方面應用較少。

二、表面修飾/鍵合相

通過對基質進行修飾或者鍵合不同的基團，形成了不同分離類型的固定相，通常包括：正相、反相、離子交換、尺寸排阻、手性等等固定相。

基質上修飾的基團極性大于流動相的極性的色譜模式稱之為正相色譜，依靠樣品極性不同在固定相和流動相產生分配的作用達到分離的目的。這種分離模式下，樣品按照極性從弱到強依次從純化柱上被洗脫下來。常用正相固定相包括：未修飾的硅膠；二醇基、氨基、氰基等硅膠基質固定相；氧化鋁等。正相硅膠固定相主要應用在合成非極性或中等極性中間體等的初步純化，常規的流動體系為正己烷/乙酸乙酯、二氯甲烷/甲醇等。其優點是純化簡單、樣品后處理簡單；缺點是分離性能不高（與反相固定相比較），重現性較差，且吸附性較強甚至對某類物質產生不可逆吸附。此外，一些極性基團（二醇基、氨基、氰基等）鍵合的正相固定相經常應用在反相條件下，對于在C18等反相固定相保留不強的極性化合物，可以獲得很好的分離純化效果。

氧化鋁固定相分為酸性、中性、堿性三種。酸性氧化鋁一般利用酸性溶劑進行預處理，具有微弱陽離子特性，表面更易保留中性和帶負電荷的物質，不能很好地保留帶正電荷的物質，主要應用在酸性色素、醛類、酸類化合物的分離純化。堿性氧化鋁通常利用堿性溶液進行預處理，具有陰離子特性并有陽離子交換功能，對極性陽離子樣品具有強吸附作用，主要應用于堿性色素、生物堿等堿性物質的分離純化。而中性氧化鋁對樣品的酸堿性不敏感，主要應用于苷、醛類和酯類等酸堿不穩定化合物。

基質上修飾的基團極性小于流動相極性的色譜模式稱之為反相色譜，這種分離模式下，樣品被洗脫下來的順序與正相模式正好相反：樣品按照極性從強到弱依次被洗脫下來。反相固定相多是以硅膠基質鍵合不同鍵合相如C18、C8、C4、C1、苯基等固定相，廣泛應用在天然產物、多肽以及蛋白質等樣品的精制純化方面，具有分離效果、重現性好、使用壽命長等特點。

尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一種根據樣品分子體積（流體力學體積）的大小進行分離的色譜模式（參見圖2）。SEC可以細化分為凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography, GPC）和凝膠過濾色譜（Gel Filtration Chromatography, GFC），基質不同，故使用的流動相也不相同。GPC目前主要的基質是交聯PS(苯乙烯-二乙烯基苯聚合物)、交聯PVAC（交聯聚乙酸乙烯酯），不同基質用不同的有機溶劑（DMF等）作為流動相，主要應用于合成有機高分子聚合物的分離純化。GFC主要基質是表面親水處理的硅膠以及交聯葡聚糖、交聯聚丙烯酰胺等等，流動相主要是水，所以GFC比較多的應用在蛋白純化。尺寸排阻模式主要的缺點是載樣量很小，且流速通常比較低，所以制備效率差；而其分離模式簡單、高回收率是它在制備純化方面的優勢。

圖2. SEC分離模式示意圖（摘自GE蛋白純化分離手冊）

離子交換色譜是通過樣品分子表面離子電荷與色譜填料表面離子電荷互相作用而達到分離的模式（參見圖3）。固定相表面呈正電荷，對陰離子有保留的稱為陰離子交換填料；固定相表面呈負電荷，對陽離子有保留的稱為陽離子交換填料。此外根據填料表面離子結合狀態的強弱還分為強離子交換填料和弱離子交換填料。陽離子交換填料常見的表面基團為磺酸基（強陽離子交換）、磷酸基、羧酸基、酚羥基；陰離子交換填料常見的表面基團為伯胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基（強陰離子交換填料）。而離子交換填料應用于制備純化時通常采用的基質是樹脂，而分析應用中出于壓力和分辨率方面的考慮硅膠基質和無孔凝膠比較多。

圖3. 陰離子交換模式示意圖（摘自GE蛋白純化分離手冊）

手性固定相是將多糖、環糊精、蛋白等衍生物鍵合或者涂覆到硅膠等基質上的固定相，對手性物質進行手性識別拆分，達到分離純化的目的。由于手性固定相非常昂貴，為了盡量保護固定相，一般對樣品化學純度要求比較高，通常樣品都經過初步純化，提高化學純度，除去易對固定相造成損傷或吸附的雜質。

三、基質參數

基質參數包括基質的形狀、粒徑以及孔徑等，這些參數要結合純化方面的具體需求進行選擇。

以應用zui廣泛的硅膠基質為例，應用于制備純化方面的硅膠基質通常分為球形和無定型兩種（參見圖4）。無定型硅膠價格低廉，是初步粗純的。與無定型硅膠相比，球型硅膠優勢非常明顯，具有以下優點：顆粒均一性好，裝填后柱床穩定不容易塌陷，多路擴散效應低，柱效高，分離度好。但其價格稍微昂貴一點，一般應用在精制純化階段。

圖4. 無定型硅膠與球形硅膠電鏡圖

基質粒徑大小直接影響柱效和分離效果，越小的粒徑所能達到的柱效越高，而選擇粒徑要具體看樣品的分離狀況，畢竟制備要考慮成本問題，越小粒徑的固定相價格越昂貴，為了達到的柱效通常越小粒徑選擇的線流速就越大，所以背壓越高，對儀器要求也高。一般粗純的時候多選擇大顆粒固定相，而當樣品附加值高，要求高純度和高得率的情況下，大多選擇小粒徑固定相。所以選擇固定相粒徑要從成本、樣品以及純化設備參數等方面綜合考慮。圖5所示為不同粒徑分離效果對比的案例。

圖5. 某中間體的分離效果圖（左圖所用Flash柱規格為25g 正相標準快速分離硅膠柱，粒徑40–63 µm；

右圖所用Flash柱規格為25g 正相快速分離硅膠柱，粒徑25–40 µm）

多孔固定相基質孔徑的選擇主要是從樣品的分子體積去考慮（表1總結了樣品分子量、樣品分子直徑以及推薦孔徑之間的關系），固定相的孔徑通常要大于樣品分子體積的三倍，才能使樣品分子有效進入固定相孔內進行充分的接觸達到分離效果。但是對于多肽類樣品分子而言，由于其分子結構呈長鏈狀，因而固定相的孔徑不必滿足上述規律。同時孔徑還與比表面積有關，其他參數一樣的情況下孔徑越小比表面積越大，而比表面積的大小在一定程度上影響分離效果和上樣情況，通常比表面積大代表表面修飾的基團多，那么分離效果就越好，載樣量也越大。

表1. 樣品分子量、樣品分子體積以及對應的推薦孔徑

四、總結

綜上所述，在進行樣品的Flash純化制備時，應根據實際的制備需求，結合樣品性質、對產物純度和得率方面的要求以及儀器配置等方面的實際情況，從基質、表面修飾/鍵合相以及基質參數三個方面綜合考慮，zui終確定純化制備zui適用的固定相。