原代細胞周期測定操作步驟

 [實驗器材]

1．儀器

原代細胞倒置顯微鏡，CO2培養箱，普通冰箱，超凈工作臺，低速冷凍離心機，顯微數碼攝影系統．水浴鍋。

2．材料與試劑

(1)非無菌材料酒精棉球，離心管架，血細胞計數板，擦鏡紙，記號筆，廢液缸，甲醇·冰醋酸，Giemsa染液．秋水仙素，2×SSC液，30W紫外燈，水浴，飯盒。

(2)無菌材料和試劑輔料鑷，6孔細胞培養板，培養瓶，15ml離心管，長絲滴管，10ml刻度移液管．滅菌塑料吸嘴，10％BS培養液，添加有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液．無菌Hank’s液，1.0mg／ml．BrdU溶液，1mol／L HCl溶液。

(3)細胞材料懸浮細胞培養物，貼壁細胞培養物。

[操作步驟]

1．取對數期生長的單細胞懸液，以一定密度接種在培養瓶或培養孔中。

2．當培養細胞進入對數生長期時，向培養液中加入BrdU，使Z終濃度為10μg／ml。

3．培養44~54h后，加入秋水仙素，終濃度為0.1μg／ml。

4．繼續培養4~6h后，常規消化細胞至離心管中，原代細胞注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

5．常規染色體制片。

6．有細胞一面向下，將染色體玻片放在一飯盒中的玻璃支架上，加入2×SSC液以不超過標本表面為宜，然后在標本上覆蓋一張擦鏡紙，使紙的兩邊浸入2×SSC液中，以保持標本的濕潤。

7．將飯盒放在56℃水浴鍋中，濕育，上面用30W的紫外燈管6~10cm垂直照射30min。

8．棄去2×SSC液和擦鏡紙，立即用4℃左右的流水沖洗。

9．Giemsa液染色5~10min，流水沖洗，干燥后鏡檢。

10．鏡檢100個細胞的分裂相，統計M1、M2、M3、M4細胞期(對應前期、中期、后期和末期這4個細胞分裂時期)分裂指數。

11．根據下式計算細胞周期

細胞周期(Tc)=48／[(Ml+2M2+3M3+4M4)／100](h)

[注意事項]

1．秋水仙素的加入時機會因細胞的類型、生長速度有所差異。

2．原代細胞加入BrdU后應避光培養。