在大多數(shù)情況下推薦用酶標(biāo)試劑，因其敏感度較高，使用普通的光學(xué)顯微鏡就可以觀察結(jié)果，如前所述。本節(jié)主要介紹熒光染料標(biāo)記試劑的使用。如需要高分辨率或同時(shí)定位兩種抗原時(shí)推薦使用此法。熒光染料標(biāo)記的檢測(cè)需要熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。

 

    在抗原制備過(guò)程中研究者常采用幾種方法固定果蠅類標(biāo)本，這就使得抗原經(jīng)受的處理更為強(qiáng)烈，通常會(huì)遇到較高背景的問(wèn)題。在果蠅類標(biāo)本的免疫組化染色中，為消除較高背景可將樣本與正常羊血清預(yù)先孵育。大部分標(biāo)記二抗試劑是羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白抗體。因而，選用非免疫羊的天然抗體來(lái)封閉非特異交互反應(yīng)性位點(diǎn)，從而降低背景。此外，通過(guò)降低抗體濃度并孵育過(guò)夜亦可降低背景。

 

    1．對(duì)照

    特異性染色反應(yīng)需要與對(duì)照進(jìn)行比較。為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)染色模式，應(yīng)對(duì)來(lái)自同一種屬的兩種抗體進(jìn)行比較。對(duì)于多克隆抗體來(lái)說(shuō)，的對(duì)照是從用于制備特異性抗體的同一動(dòng)物免疫前采集的血清，但已可以使用來(lái)自同種動(dòng)物的非免疫血清。對(duì)于單克隆抗體來(lái)說(shuō)，對(duì)照應(yīng)該是與特異性抗體的來(lái)源相同；例如，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)比上清，小鼠腹水對(duì)比腹水，純化抗體對(duì)比純化抗體。對(duì)照抗體應(yīng)該與特異性抗體的類和亞類相同。來(lái)自親代骨髓瘤的細(xì)胞培養(yǎng)上清不宜作為對(duì)照，因其中不含抗體。適宜的對(duì)照雜交瘤細(xì)胞株可從美國(guó)ATCC或歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心獲得。此外，對(duì)二級(jí)試劑亦應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

 

    2．準(zhǔn)備工作

    進(jìn)行抗體結(jié)合和檢測(cè)重要的準(zhǔn)備工作是進(jìn)行一抗和二抗的滴度測(cè)定。雖然在下述方法中建議抗體的加入初始量，但在免疫染色中應(yīng)調(diào)整一抗、二抗的用量，以便達(dá)到足以引起強(qiáng)大有效信號(hào)的低濃度，以免發(fā)生非特異性染色。對(duì)每一種抗體（存在于蛋白緩沖液中，如1％IgG／PBS）做一系列稀釋并觀察其對(duì)靶細(xì)胞的染色效應(yīng)。1／3稀釋（1份抗體中加入2份緩沖液）將接近其半對(duì)數(shù)值，并對(duì)所加入量進(jìn)行合適的快速測(cè)定。對(duì)于*抗體的每一個(gè)滴度測(cè)定應(yīng)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。而二抗一旦確定其稀釋度，就可以作為該批抗體的標(biāo)準(zhǔn)用量。如有可能，應(yīng)該對(duì)攜帶所研究抗原基因缺失的果蠅類標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行染色。這將為特異性抗體提供一個(gè)*的遺傳對(duì)照。

 

    3．所需溶液與試劑

    *抗體溶液；第二抗體（多數(shù)來(lái)自商品試劑）；PBS；含1％正常羊IgG的PBS。

 

    4．特殊設(shè)備

    熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。