色譜柱利用色譜柱先將混合物分離，然后利用檢測器依次檢測已分離出來的組分。色譜柱的直徑為數(shù)毫米，其中填充有固體吸附劑或液體溶劑，所填充的吸附劑或溶劑稱為固定相。與固定相相對應(yīng)的還有一個流動相。流動相是一種與樣品和固定相都不發(fā)生反應(yīng)的氣體，一般為氮或氫氣。待分析的樣品在色譜柱頂端注入流動相，流動相帶著樣品進入色譜柱，故流動相又稱為載氣。載氣在分析過程中是連續(xù)地以一定流速流過色譜柱的；而樣品則只是一次一次地注入，每注入一次得到一次分析結(jié)果。
在實驗過程中經(jīng)常遇到的情況：
(1) 新的色譜柱，直接上分析條件來分析樣品，發(fā)現(xiàn)分離情況不穩(wěn)定。
(2) 新的色譜柱，使用中發(fā)現(xiàn)壓力突然升高。
(3) 新的色譜柱，發(fā)現(xiàn)分離度、保留時間發(fā)生了變化。
(4) 色譜柱使用不頻繁，一開始分析樣品效果比較好，但是，在使用過程中發(fā)現(xiàn)柱效下降快、峰形異常的情況。
(5) 色譜峰形異常，基線不穩(wěn)。
當(dāng)發(fā)生以上情況，請仔細檢查，是否有某個操作疏忽了？
1）測試柱性能
通常情況下，我們建議用戶在拿到色譜柱后，件事情就是在一臺性能完好的儀器系統(tǒng)上，按照廠家說明書對色譜柱進行柱效測試。其實，對于一個合格的色譜分析工作者來說，拿到一根新色譜柱，要開始一個課題之前，都會這樣做，目的有二：1、了解色譜柱之前的情況并判斷色譜柱是否正常。2、將檢測結(jié)果小心保存， 當(dāng)實驗過程中發(fā)現(xiàn)異常時，在檢測柱效進行對比，來進一步排查原因。
2）當(dāng)反相使用高濃度緩沖鹽時，注意過渡
在使用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑時，一定要注意應(yīng)先用10％左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，造成系統(tǒng)堵塞。另外，在發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)壓力升高異常時，要仔細檢查，段段排除包括保護柱、混合器、管路或者流通池等。
3）當(dāng)更換色譜柱時，原來的實驗情況發(fā)生變化
首先，如果之前開發(fā)方法時色譜柱已經(jīng)做過別的樣品，那么之前的樣品或使用的流動相對這個樣品分析可能有干擾，只能重新找條件。建議：開發(fā)方法時使用新的色譜柱。（其次，如果是更換了品牌發(fā)生這樣的情況，可能是由于不同品牌的鍵合技術(shù)不同，造成了選擇性的細微差異 ，需要調(diào)整條件，并再次確定出峰順序（有些樣品的洗脫順序會改變）。再次，如果是更換了同品牌型號的新的色譜柱發(fā)生這種情況，請檢查之前分離時目標(biāo)與雜質(zhì)的分離度是否符合要求（Rs大于1.5），如果一開始只是勉強分開（Rs小于1.5），那只能說明方法沒有優(yōu)化好，需要再次進行優(yōu)化。
4）樣品及前處理
樣品要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱（SPE）對樣品進行預(yù)處理；若樣品不便處理，要使用保護柱。流動相中所使用的各種有機溶劑要使用色譜純，配流動相的水是超純水或雙蒸水。如果將所配得流動相再經(jīng)過0.45μm的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換。
5）色譜柱基線問題
通常情況，基線問題是由于系統(tǒng)或者流動相引起的，和色譜柱關(guān)系不大。
可能導(dǎo)致的原因：
（1）泵頭進氣泡
（2）系統(tǒng)污染
（3）流通池漏液
（4）流動相使用的某成分易揮發(fā)不穩(wěn)定（檢測波長不合適）
（5）檢測波長低，水的質(zhì)量不好等等
（6）色譜柱沖洗保養(yǎng)
當(dāng)使用了緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用10%的甲醇水溶液沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入至少10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。還有就是不能在這個工作上面打折扣，否則，一些保留強的雜質(zhì)沒有洗脫下來，只能是給后面的工作帶來更大的麻煩。如色譜柱要長時間保存，可以儲存于純甲醇或乙腈中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度是室溫。
