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PCR反應條件優化控制

時間:2025/6/9閱讀:155
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PCR反應條件優化控制:

1.  PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。 

2.  鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L。 

3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200 umol/L。 

4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。  

5.  引物 濃度一般為0.1 ~0.5 umol/L。

6.  反應溫度

(1)變性溫度和時間95℃,30 s。

(2)退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

(3)延伸溫度和時間72℃,1 min/kb(10 kb內)。

(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循環次數 :一般為25 ~30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低,可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右,循環數超過30個以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產物的量不再隨循環數的增加而增加,出現了所謂的“平臺期"。



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