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PCR反應(yīng)條件優(yōu)化控制:
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
5. 引物 濃度一般為0.1 ~0.5 umol/L。
6. 反應(yīng)溫度
(1)變性溫度和時(shí)間95℃,30 s。
(2)退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。
(3)延伸溫度和時(shí)間72℃,1 min/kb(10 kb內(nèi))。
(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循環(huán)次數(shù) :一般為25 ~30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右,循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后,DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和,產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,出現(xiàn)了所謂的“平臺期"。
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