DGGE1102/1104變性梯度凝膠電泳/DGGE1102/1104時(shí)間溫度梯度凝膠電泳系統(tǒng)
DGGE介紹：變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達(dá)100％，檢測(cè)片段可達(dá)1kb，圍為100bp-500bp?；驹砘诋?dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由于變性梯度凝膠電泳法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測(cè)，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測(cè)發(fā)生于高熔點(diǎn)區(qū)的突變。
DGGE原理：變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增微生物自然群體的16s rRNA基因，產(chǎn)生長(zhǎng)度相同但序列有異的DNA片段的混合物。然后用變性梯度凝膠電泳分離產(chǎn)物混合物。變性梯度凝膠電泳DGGE膠是在6％聚丙烯酰胺膠中添加線性梯度的變性劑，變性劑的濃度由上到下，從低到高成線性梯度。在一定溫度下，在同一濃度的變性劑濃度下，序列不同的產(chǎn)物，其部分解鏈程度也不同，而產(chǎn)物解鏈程度又直接影響其電泳遷移率，結(jié)果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開來。在引物的5’端加上40個(gè)堿基左右的G-C串可使變性梯度凝膠電泳DGGE對(duì)序列差異的分辨率提高到近100％。所以變性梯度凝膠電泳法可用于微生物群落結(jié)構(gòu)的研究、微生物種群動(dòng)態(tài)的分析、富集培養(yǎng)物及分離物的分析、核糖體RNA同源性的分析。但由于在PCR擴(kuò)增過程中可能存在堿基插入的錯(cuò)誤、不同微生物細(xì)胞破壁難易的不同等而造成分析結(jié)果的偏差。
DGGE應(yīng)用領(lǐng)域：DGGE變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)主要應(yīng)用于環(huán)境樣品細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、真核微生物的多樣性分析（土壤、水等樣品無需培養(yǎng)，直接提取DNA擴(kuò)增檢測(cè)）動(dòng)、植物體內(nèi)外共生微生物的檢測(cè)；食品微生物的檢測(cè)；醫(yī)學(xué)領(lǐng)域堿基突變的檢測(cè)，雜合子檢測(cè)等等。
DGGE的特點(diǎn)：DGGE凝膠具有變性劑濃度梯度，可以根據(jù)DNA片段的退火溫度分辨不同片段，分辨率可達(dá)到一個(gè)堿基。DGGE具有精密控溫系統(tǒng)，比一般聚丙烯酰胺凝膠電泳具有更高的可重復(fù)性。DGGE可以對(duì)環(huán)境樣品DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離進(jìn)而克隆測(cè)序，比一般聚丙烯酰胺凝膠電泳僅僅根據(jù)片段長(zhǎng)短進(jìn)行分離前進(jìn)了一大步。幾乎可以檢出所有突變，無須對(duì)引物標(biāo)記。
可將突變分子完好無損地同野生型分子分開用于進(jìn)一步的分析。可檢測(cè)流感病毒基因多樣性，遺傳圖譜分析，單核苷酸差異SNP檢測(cè)?？蓹z測(cè)出象甲基化之類的DNA修飾。
DGGE實(shí)驗(yàn)流程：DNA樣品的提取→ PCR擴(kuò)增→ DGGE電泳→ 帶型分析→ 特征條帶的測(cè)序
DGGE技術(shù)指標(biāo)：
兩段程控，每段最長(zhǎng)時(shí)間24小時(shí)，控制精度1秒
電壓范圍0-200V，精度0.1%，電流范圍0-150mA，紋波系數(shù)0.1%
微電腦智能控制，中文液晶顯示，具有過壓、過流、過載和報(bào)警等裝置
鉑金電極插座裹覆于安全覆蓋內(nèi)，避免意外觸及,降低緩沖區(qū)因高溫蒸發(fā)
緩沖式槽體以玻璃材質(zhì)制成，于電泳作業(yè)時(shí)，不因高溫變形
完善的加熱，攪拌，緩沖檢測(cè)組件設(shè)計(jì)，使溫度分布均勻達(dá)±0.2ºC
其中緩沖檢測(cè)設(shè)計(jì)無需額外的蠕動(dòng)泵，使緩沖區(qū)循環(huán)效果達(dá)狀態(tài)
高精度和高可靠性,可對(duì)單堿基突變進(jìn)行檢測(cè).
TTGE 時(shí)間溫度梯度凝膠電泳系統(tǒng)采用DGGE 變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)的原理但不使用化學(xué)變性劑梯度，操作更簡(jiǎn)單、快速并便于重復(fù)。DNA 上樣于含尿素的聚丙烯酰胺凝膠。電泳過程中逐步、均一地升高溫度，從而在電泳運(yùn)行過程中產(chǎn)生一個(gè)線性的溫度梯度，變性環(huán)境由凝膠中均一的尿素濃度加上時(shí)間溫度梯度形成。
TTGE原理：
雙鏈 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的 DNA 片段能夠被區(qū)分開，但同樣長(zhǎng)度的 DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。TTGE 時(shí)間溫度梯度凝膠電泳技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了尿素和甲酰胺梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的 DNA 片段區(qū)分開來。一個(gè)特定的 DNA 片段有其的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個(gè)幾百個(gè)堿基對(duì)的 DNA 片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成。當(dāng)溫度逐漸升高達(dá)到其的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對(duì)發(fā)生解鏈，當(dāng)溫度再升高依次達(dá)到各其他解鏈區(qū)域。
TTGE應(yīng)用領(lǐng)域：
TTGE 時(shí)間溫度梯度凝膠電泳系統(tǒng)技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的一個(gè)主要用途是分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括土壤、活性污泥、人體和動(dòng)物腸道、溫泉、植物根系、海洋、淡水湖、油藏等。絕大部分研究都是通過擴(kuò)增細(xì)菌或古細(xì)菌的16S rRNA 基因來研究各生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌或古細(xì)菌群落多樣性。也有用真菌的通用引物擴(kuò)增 18S rRNA 基因，從而研究真菌的群落多樣性。
TTGE技術(shù)指標(biāo)：
溫度控制器與加熱器可使溫度緩慢地以0.1°C/hr 的速度上升
無需化學(xué)梯度，電泳時(shí)間由16小時(shí)縮短為5-8小時(shí)，使設(shè)置和制膠更方便
對(duì)照試劑與已證明有效的規(guī)程使你可以立即開展實(shí)驗(yàn)
全中文液晶顯示，微電腦智能控制，具有過壓、過流、過載和報(bào)警等裝置
系統(tǒng)可對(duì)溫度、時(shí)間等信息進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，開蓋自動(dòng)切斷電源
分辨率高，溫度梯度由微處理器控制，線性極為嚴(yán)格
節(jié)約時(shí)間，小面積溫度梯度板和小尺寸凝膠，只需要少量的凝膠溶液
加樣品量小，1～5mg的DNA或RNA上樣品量即可達(dá)到清晰的電泳分離效果
重現(xiàn)性好，電泳條件(如溫度、時(shí)間等)易于控制，可以保證電泳的重現(xiàn)性和結(jié)果的重復(fù)性
